AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒

AnnexinV-FITC/PI Apoptosis Detection Kit

● 產(chǎn)品組成：

●  產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V 是一種分子量為35～36kD 的Ca2+依賴(lài)性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過(guò)細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V 進(jìn)行熒光素FITC 標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI 能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V 與PI 匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細胞區分開(kāi)來(lái)。

以每次使用5 μl Annexin V-FITC計算，本試劑盒FP2050M可以檢測50個(gè)樣品。

●  包裝組份：

●  保存條件：

4oC保存，一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。

● 操作步驟：

一. 懸浮細胞操作流程：

1.1 誘導凋亡的操作步驟 (以Jurkat細胞為例)：

1.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Jurkat細胞懸液。

1.1.2 加入終濃度為1 μM 的凋亡誘導劑 (STS，Staurosuporine，星孢菌素)。

1.1.3 在37℃培養箱培養3 h。

注：1 μM Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。最佳誘導條件請根據實(shí)驗的細胞類(lèi)型與誘導劑調整。

1.2 Annexin V染色操作步驟：

1.2.1 將細胞懸液轉移到離心管中，500 g（2500 rpm）離心3 min，去除上清液。

1.2.3沉淀中加入PBS，500 g（2500 rpm）離心 3 min，去除上清液。重復漂洗一次。

1.2.4加入Annexin V-FITC結合液，制成終濃度為1×10⁶ 個(gè)/ml的細胞懸液。

注：加入結合液的體積根據實(shí)驗目的自行調整，一般推薦不少于500 μl。

1.2.5 取100 μl步驟1.2.4中制備的細胞懸液，加入到一個(gè)新的離心管中。

1.2.6 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

1.2.7 常溫下避光放置15 min，即為待檢液。

1.3 結果檢測：

1.3.1 流式細胞儀檢測：

步驟1.2.7中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結合液。激發(fā)波長(cháng)Ex = 488 nm；發(fā)射波長(cháng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道 (FL1) 檢測；PI的紅色熒光通過(guò)PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議1小時(shí)內完成檢測。

1.3.2 熒光顯微鏡檢測：

取步驟1.2.7的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液，封片觀(guān)察。

注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測。

二. 懸浮細胞操作流程：

2.1 誘導凋亡的操作步驟 (以Caco-2細胞為例)：

2.1.1 制備1×10⁶個(gè)/ml 的Caco-2細胞懸液，將細胞懸液接種到培養皿或者培養板中。

2.1.2 在37℃ 5% CO₂培養箱中預培養。

2.1.3加入終濃度為25 μM的凋亡誘導劑 (Cisplatin，順鉑)。

2.1.4 在37℃5% CO₂培養箱中培養4 days。

2.2  Annexin V染色操作步驟：

2.2.1吸出細胞培養液至離心管中待用，細胞用PBS洗滌，加入適量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。

2.2.2 常溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來(lái)時(shí)，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過(guò)度消化。

2.2.3加入步驟2.2.1中收集的細胞培養液，稍混勻，轉移到離心管內，2000 rpm 5 min，小心吸除上清。

注意：加入的細胞培養液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會(huì )消化并降解后續加入的Annexin V-FITC導致染色失敗。

2.2.4 細胞沉淀中加入預冷PBS輕輕重懸細胞，2000 rpm 5 min，小心吸除上清；重復洗滌一次。

2.2.5細胞沉淀中加入適量Annexin V-FITC結合液，制成終濃度為1×10⁶ 個(gè)/ml的細胞懸液。

注：加入結合液的體積根據實(shí)驗目的自行調整，一般推薦不少于500 μl。

2.2.6 取100 μl步驟2.2.5中制備的細胞懸液，加入到一個(gè)新的離心管中。

2.2.7 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl 碘化丙啶染色液。

2.2.8 常溫下避光放置15 min，即為待檢液。

2.3 結果檢測：

2.3.1 流式細胞儀檢測：

步驟2.2.8中的待檢液中加入400 μl Annexin V-FITC結合液。激發(fā)波長(cháng)Ex = 488 nm；發(fā)射波長(cháng)Em = 530 nm。Annexin V-FITC的綠色熒光通過(guò)FITC通道 (FL1) 檢測；PI的紅色熒光通過(guò)PI 通道 (FL2或FL3) 檢測。注：熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議1小時(shí)內完成檢測。

2.3.2 熒光顯微鏡檢測：

取步驟2.2.8的待檢液5 μl滴于載玻片上，加5μl 抗熒光淬滅封片液，封片觀(guān)察。

檢測程序：

Jurkat細胞調整到1×10⁶/ml，6孔板接種2 ml；凋亡處理加10 μl 0.2 M STS（星型飽菌素），終濃度為1 μM；37度 5%二氧化碳培養3小時(shí)；2 ml收集，PBS漂洗2次，重懸于300 μl 結合液中；調整細胞密度為1×10⁶/ml制成細胞懸液。取100 μl細胞懸液加5 μl Annexin V-FITC，5 μl 碘化丙啶染色液，RT 避光靜置15min，取5 μl加5 μl封片液，封片觀(guān)察。FITC（+）PI（+）為凋亡晚期細胞（40×）。

● 注意事項：

1. 本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時(shí)，細胞數量不應低于1×10⁶，不推薦用于檢測組織樣本。

2. 推薦使用懸浮培養細胞。如果是貼壁細胞，需用不含 EDTA 的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽(yáng)性，而用細胞刮子會(huì )造成細胞粘連成團，而影響檢測。

3. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

4. 消化貼壁細胞殘留的胰酶會(huì )消化并降解Annexin V-FITC，最終導致染色失敗。

5 .因檢測細胞的類(lèi)型、凋亡誘導劑種類(lèi)、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導處理的細胞作為對照，進(jìn)行熒光補償的調節。