RIPA裂解液(強,不含抑制劑,不含螯合劑)
● 產(chǎn)品包裝:
產(chǎn)品編號
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產(chǎn)品名稱(chēng)
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包裝
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說(shuō)明書(shū)
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RL0120F
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RIPA裂解液(強,不含抑制劑,不含螯合劑)
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100 ml
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1份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
RIPA裂解液(RIPA Lysis
Buffer)是一種傳統的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的配方有很多種,根據其裂解液的強度大致可以分為強、中、弱三類(lèi)。該RIPA裂解液(強)的主要成分為50 mM Tris (pH 7.4),150 mM NaCl,1% Triton
X-100,1%
sodium deoxycholate,0.1% SDS,不含蛋白酶抑制劑,不含磷酸酶抑制劑,不含螯合劑如EDTA或EGTA,可適用于明膠酶譜實(shí)驗的蛋白提取。使用前根據實(shí)驗需要添加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑以及EDTA或EGTA。
用該RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品,可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。由于含有較高濃度的去垢劑,不能用Bradford法測定蛋白濃度。
● 保存、效期及運輸:
-20℃保存,有效期一年,濕冰運輸。
● 注意事項:
1.為取得最佳的使用效果,盡量避免過(guò)多的反復凍融??梢赃m當分裝后使用。需自備PMSF。裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
2. RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會(huì )出現一小團透明膠狀物,屬常見(jiàn)現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測與基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下,可以直接離心取上清用于后續實(shí)驗;如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白,則可以通過(guò)超聲處理打碎打散該透明膠狀物,隨后離心取上清用于后續實(shí)驗。如果檢測一些常見(jiàn)的轉錄因子,例如NF-kappaB、p53等時(shí),通常不必進(jìn)行超聲處理,就可以檢測到這些轉錄因子。
● 使用說(shuō)明:
1. 準備RIPA裂解液:
融解RIPA裂解液,混勻;取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入1/100體積的100 mM PMSF,使PMSF的最終濃度為1 mM。
注:進(jìn)行明膠酶譜實(shí)驗提取蛋白樣品時(shí),不要添加EDTA或EGTA,以免螯合掉MMP活性需要的二價(jià)陽(yáng)離子;蛋白酶抑制劑也要選擇性添加,不要添加金屬蛋白酶抑制劑,可以添加PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)。
2. 細胞蛋白提?。?/b>
2.1 貼壁細胞:去除培養液,加入適量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動(dòng)貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸,冰上裂解細胞5分鐘,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離心管中,冰上繼續裂解15分鐘,間歇混勻。
培養板規格/培養皿表面積
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細胞量
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RIPA推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞:450 g
4℃ 離心5 min收集細胞;用適量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重復漂洗細胞一次;按照細胞沉淀體積(PCV)20 μl加入200 μl RIPA的比例加入RIPA,混勻細胞沉淀,冰浴處理15分鐘,間歇混勻。
注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉淀體積(PCM,Packed Cell Volume)大約為20 μl。
2.3 裂解細胞:
裂解混合物超聲波處理(超聲條件根據儀器調整,建議條件為);如沒(méi)有超聲破碎儀,可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次,以徹底裂解細胞。冰浴處理15分鐘。
注:裂解中細胞會(huì )釋放出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理,會(huì )導致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和純度。
2.4 離心收集上清:
充分裂解后,4℃ 16000
g離心10分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
3. 組織樣品蛋白提?。?/b>
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數次,洗凈組織血跡,用濾紙吸
干組織表面液體,將組織切成細小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次,收集勻漿后的裂解混合物,超聲波處理(超聲條件根據儀器調整,建議條件為);如沒(méi)有超聲破碎儀,可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次,以徹底裂解細胞。裂解物冰浴處理15分鐘。
注:裂解中細胞會(huì )釋放出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理,會(huì )導致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和純度。
3.4 充分裂解后,4℃ 16000
g離心10分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。