SDS裂解液
● 產(chǎn)品包裝:
貨號
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名稱(chēng)
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規格
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RL1060
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SDS裂解液
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100
ml
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
SDS裂解液(SDS Lysis Buffer)是一種比較強烈的細胞組織裂解液,其主要成分是Tris (pH8.0), SDS,EDTA等。SDS裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規的Western、ChIP(染色質(zhì)免疫共沉淀,chromatin immunoprecipitation)等。由于SDS裂解液有較強的裂解能力,IP或Co-IP實(shí)驗不建議使用該裂解液。由于含有較高濃度的SDS等干擾物質(zhì),不能用傳統Bradford法測定由本裂解液裂解得到樣品的蛋白濃度,可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:RTP7102)或Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)(貨號:RTP7104)測定蛋白濃度。
● 貯存、效期及運輸:
常溫保存;有效期2年;常溫運輸。
● 注意事項:
1. 需自備蛋白酶抑制劑如PMSF。
2. 如果使用本SDS裂解液用于ChIP實(shí)驗,在對超聲后基因組DNA大小進(jìn)行檢測時(shí),如果采用瓊脂糖凝膠中添加花菁素類(lèi)染料如GelRed或類(lèi)似染料或使用含該類(lèi)染料的DNA上樣緩沖液時(shí),由于電泳時(shí)SDS會(huì )與此類(lèi)染料結合形成異常條帶,條帶通常在600-1000 bp左右,因此會(huì )對超聲后基因組DNA大小的判斷造成一定的影響。建議采用后染方法即“電泳完畢后對瓊脂糖凝膠染色”的方式進(jìn)行條帶大小的檢測,使用該方法不會(huì )有異常條帶出現,不影響對超聲后基因組DNA大小的判斷,而且條帶大小更準確。
● 使用說(shuō)明:
1. 準備SDS裂解液:
取適當量的裂解液,在使用前數分鐘內加入1/100體積的100 mM PMSF(貨號:PM1790),使PMSF的最終濃度為1 mM或加入其他蛋白酶抑制劑。
注:SDS裂解液低溫會(huì )析出結晶,以下操作需保持常溫操作。
2. 細胞蛋白提?。?/b>
2.1 貼壁細胞:去除培養液,加入適量1×PBS,輕柔漂洗一遍,不要擾動(dòng)貼壁細胞。按照6孔板每孔加入100-200 μl裂解液的比例加入裂解液,移液器吹打數下,使裂解液和細胞充分接觸,用細胞刮刀刮下細胞收集于1.5 ml離心管中。
培養板規格/培養皿表面積
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細胞量
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裂解液推薦使用量
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100 mm培養皿
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1.5×107
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0.5-1 ml
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60 mm培養皿
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5×106
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0.25-0.5 ml
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35 mm培養皿
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2×106
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0.2-0.4 ml
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6孔板
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2.5×106
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100-200 μl
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24孔板
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5×105
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100-150 μl
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96孔板
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1×105
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50-100 μl
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2.2 懸浮細胞:450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;用適量1×PBS重懸細胞,450 g 4℃ 離心5 min收集細胞;重復漂洗細胞一次;按照細胞沉淀體積(PCM)20 μl加入200 μl 裂解液的比例加入SDS裂解液,混勻細胞沉淀。
注:2×106 Jurkat細胞,其細胞沉淀體積(PCM,Packed Cell Volume)大約為20 μl。
2.3 裂解細胞:
2.3.1 裂解混合物超聲波處理(超聲條件根據儀器調整);如沒(méi)有超聲破碎儀,可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次(貨號:PE2719 ,蛋白提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。
注:裂解中細胞會(huì )釋放出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理,會(huì )導致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和純度。
2.3.2 裂解物95℃處理10分鐘,間歇混勻。
2.4 離心收集上清:
充分裂解后,常溫16000 g離心10分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的PAGE、Western等操作。
3. 組織蛋白提?。?/b>
3.1 手術(shù)切除的組織塊迅速置于預冷的生理鹽水中,漂洗數次,洗凈組織血跡,用濾紙吸
干組織表面液體,將組織切成細小的碎片。
3.2 按照每20 mg組織加入200 μl裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,如果需要高濃度的蛋白樣品,可以適當減少裂解液的用量。)
3.3 用玻璃勻漿器勻漿5-10次,收集勻漿后的裂解混合物,超聲波處理(超聲條件根據儀器調整);如沒(méi)有超聲破碎儀,可以使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次(貨號:PE2719 ,蛋白提取針頭套裝),以徹底裂解細胞。
注:裂解中細胞會(huì )釋放出變性的核酸,呈團狀粘稠透明樣,如不進(jìn)行超聲或針頭裂解處理,會(huì )導致裂解物非常粘稠,大大降低蛋白提取的得率和純度。
3.4 裂解物95℃處理10分鐘,間歇混勻。
3.5 常溫16000 g離心10分鐘,取上清,即可進(jìn)行后續的PAGE、Western等操作。
● 實(shí)驗示例:
4-18% RealPAGE 預制膠
電泳條件:1×TGS 穩壓200V
38-13mA 50min;染色:FastBlue蛋白染色液染色30min。
樣品1(LD直裂):2 ml K562細胞(6.5×106/ml),3000rpm
5min,沉淀用PBS清洗1次,離心后徹底去除PBS,加入130 μl超純水,100 μl5×loading
buffer(變性,還原),95度10 min,上樣5 μl。
樣品2(4K-BME):1 ml 4K細菌細胞(O/N培養),13000 rpm 5min,離心后徹底去除殘余液體,加入130 μl超純水,100 μl
5×loading buffer,95度10min,上樣7.5 μl。
樣品3:1 ml K562細胞(5×106/ml),3000 rpm 5
min,沉淀用PBS清洗1次,離心后徹底去除PBS,加入500 μl SDS裂解緩沖液,超聲處理(10%功率,開(kāi)5S,關(guān)10S,2min),冰浴10 min或95度10min,間歇混勻,13000 rpm低溫離心10 min,取上清即為總蛋白。加入5×loading
buffer(變性,還原)調整樣品濃度為2 μg/μl,95度5min,上樣5,7.5和10 μl。