RealPAGE plus彩色凝膠快速制備試劑盒
RealPAGE plus Colour Gel Fast Preparation Kit
● 貨品規格:
貨號
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說(shuō)明
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制膠數量
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RTD6132-06
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制備6%PAGE膠
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125塊 0.75mm膠
>90塊1 mm膠
>60塊1.5 mm膠
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RTD6132-08
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制備8%PAGE膠
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RTD6132-10
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制備10%PAGE膠
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RTD6132-12
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制備12%PAGE膠
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RTD6132-15
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制備15%PAGE膠
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● 貨品內容:
組份
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貨號
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名稱(chēng)
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規格
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保存
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1
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RTD6132-UA
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上層膠溶液A
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80 ml
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4℃
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2
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RTD6132-UB
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彩色上層膠溶液B
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80 ml
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4℃
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3
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RTD6132-LA06
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下層膠溶液A 6%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA08
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下層膠溶液A 8%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA10
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下層膠溶液A 10%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA12
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下層膠溶液A 12%
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250 ml
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4℃
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RTD6132-LA15
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下層膠溶液A 15%
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250 ml
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4℃
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4
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RTD6132-LB
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下層膠溶液B
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250 ml
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4℃
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5
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RTD6132-SP
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改良型促凝劑
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8 ml
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4℃,配制后-20℃貯存
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
該產(chǎn)品利用聚丙烯酰胺凝膠電泳原理,采用合理設計的預混合配方和配制流程,可在50分鐘內配制得到高質(zhì)量的聚丙烯酰胺凝膠,用于變性和非變性蛋白凝膠電泳。本產(chǎn)品可以配制常用分離膠濃度6%、8%、10%、12%和15%,可以滿(mǎn)足絕大多數蛋白電泳需求。
本試劑盒大約可以配制60-125塊常規大?。?×10cm)PAGE凝膠,具體數量根據凝膠厚度決定:0.75mm厚度凝膠可以配制125塊膠,1mm厚度凝膠可以配制至少90塊膠,1.5mm厚度凝膠可以配制至少60塊膠。
● 運輸和貯存:
本產(chǎn)品常溫運輸;組份按照標簽溫度貯存;有效期一年。
● 特點(diǎn):
1. 方便:彩色上層膠,方便上樣;上層膠和下層膠溶液1:1混合,無(wú)需計算;
2. 安全:不用接觸有毒粉末;不用單獨添加TEMED;
3. 兼容性廣:制膠溶液中不含SDS,可用于非變性電泳(Native-PAGE);
● 使用說(shuō)明:
一 凝膠制備:
1.1參照凝膠模具說(shuō)明書(shū),裝配好凝膠模具。
1.2 根據下表參考選擇合適的凝膠濃度
表一不同濃度的PAGE下層膠的最佳分離范圍
下層膠(分離膠)濃度
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最佳分離范圍
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6%
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50-350 kD
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8%
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35-300 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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1.3 根據下表配制凝膠:
表二 凝膠配制表
下層膠配方
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上層膠配方
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膠厚度
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下層膠溶液B
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下層膠溶液A
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改良型促凝劑
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膠厚度
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彩色上層膠溶液B
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上層膠溶液A
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改良型促凝劑
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0.75 mm
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2 ml
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2 ml
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40 μl
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0.75 mm
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0.5 ml
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0.5 ml
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10 μl
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1.0 mm
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2.5 ml
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2.5 ml
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50 μl
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1.0 mm
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0.75 ml
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0.75 ml
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15 μl
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1.5 mm
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4 ml
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4 ml
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80 μl
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1.5 mm
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1 ml
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1 ml
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20 μl
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1.3.1 取等體積下層膠溶液B 和下層膠溶液A ,各 2.0/2.5/4.0 ml,混勻;
1.3.2混合溶液中加入 40/50/80 μl的改良型促凝劑,輕輕混勻,將混勻后的溶液注入制膠玻璃板中,使液面和短玻璃板上沿之間的距離比梳齒長(cháng)0.5 cm即可;
注意:此溶液為過(guò)量,請勿全部注入。
1.3.3 沿玻璃板緩慢加入適量滅菌水或無(wú)水乙醇覆蓋于下層膠之上,待下層膠凝固后,倒去上層水或乙醇;
注意:當水(乙醇)和膠之間有一條折射線(xiàn)時(shí),說(shuō)明膠已凝固;25℃時(shí)5-10分鐘可以聚合。
1.3.4 取等體積彩色上層膠溶液B和上層膠溶液A ,各 0.5/0.75/1.0 ml,混勻;
1.3.5向混合溶液中加入 10/15/20 μl 的改良型促凝劑,輕輕混勻,插入梳齒;
1.3.6 待上層膠凝固后 (約20-40 min),拔去梳齒即可用于電泳。
注:凝膠的聚合時(shí)間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時(shí),聚合較快;冬天氣溫低時(shí),聚合時(shí)間會(huì )延長(cháng)。
上層膠25℃ 20-25分鐘可以聚合;18℃ 35-40分鐘可以聚合。
二 電泳:
2.1 SDS-PAGE變性電泳:
2.1.1電泳緩沖液配制:
將5×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液干粉(自備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris,0.5% SDS)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.1.2 樣品處理:融化-混合-變性-上樣
5×MonoColor蛋白上樣緩沖液常溫數分鐘解凍后輕輕搖勻,以確保溶液混合均勻;將緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻,如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;將蛋白樣品置于95℃中加熱5-10分鐘;蛋白樣品加入凝膠加樣孔內電泳。
2.1.3 電泳過(guò)程;
在電泳槽的內槽內加入1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
表三 SDS-PAGE電泳條件
恒電壓
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起始電流(一板膠)
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結束電流(一板膠)
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電泳時(shí)間
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適用條件
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150V
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35-40 mA
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15-20 mA
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55 + min
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最佳電壓,最優(yōu)的分辨率
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200V
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45-55 mA
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20-25 mA
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45+ min
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節省時(shí)間
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225V
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40-50 mA
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15-20 mA
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35+ min
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250V
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65-75 mA
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20-25 mA
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30+ min
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300V
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70-80 mA
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25-35mA
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25+ min
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最省時(shí)間
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2.2 非變性電泳(Native PAGE):
2.2.1電泳緩沖液配制:
將5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液干粉(自備,組份0.96 M 甘氨酸,0.125 M Tris)全部倒入1L燒杯中,加入約900 ml水徹底溶解,用水定容至1 L,即配成5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(此溶液不用調節pH值)。用前再稀釋5倍即配成1×Tris-甘氨酸-SDS電泳緩沖液。
2.2.2 樣品處理:融化-混合-上樣
5×非變性非還原蛋白上樣緩沖液常溫數分鐘解凍后輕輕搖勻,以確保溶液混合均勻;將緩沖液與蛋白樣品按照1:4的比例混勻,如8 μl樣品加入2 μl 5×上樣緩沖液;蛋白樣品加入凝膠加樣孔內電泳。注:非變性電泳樣品不能加熱處理。
2.2.3 電泳過(guò)程;
在電泳槽的內槽內加入1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過(guò)加樣孔),輕輕的撥出梳子,用1ml吸頭徹底沖洗加樣孔,隨后在電泳槽外槽加入適量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
表四 Native PAGE電泳條件
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時(shí)間
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適用條件
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推薦電壓
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150V
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25-35/板膠
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5-10 mA/板膠
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60 + min
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最佳電壓,最優(yōu)的分辨率
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三. 染色:
1. 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中,加入適量FastBlue蛋白染色液或常規考馬斯亮藍染色液(以剛剛覆蓋過(guò)膠面為適),條帶1-2分鐘即可見(jiàn)。
2. 搖床常溫搖動(dòng)10-15分鐘至條帶清晰可見(jiàn)。
3. 加入適量蒸餾水脫色,期間更換1-2次蒸餾水,搖床常溫搖動(dòng)10-15分鐘至背景干凈。
4. 觀(guān)察保存結果。
四. 實(shí)驗示例: