昆蟲(chóng)基因組DNA提取試劑盒

Insect Genomic DNA Isolation Kit

● 試劑盒內容及保存：

● 儲存條件和效期：

室溫保存，12個(gè)月內有效。緩沖液IL與緩沖液 IB可能有沉淀產(chǎn)生，37℃水浴溶解后即可。RNase A和蛋白酶K常溫運輸，-20℃保存。

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

該試劑盒采用獨特的裂解液能夠有效除去多糖多酚等，能夠從昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、節肢動(dòng)物、蛔蟲(chóng)等樣品中提取DNA，保存在醇類(lèi)的樣品也適用于本試劑盒的提取。一次操作可以處理小于50mg組織，樣品經(jīng)裂解液消化，氯仿分離除去大部分的多糖多酚，再經(jīng)分離柱進(jìn)一步純化，便可得到高純度的DNA。所得的DNA可以用于PCR，Southern雜交，酶切消化等實(shí)驗。

● 準備工作：

1. 準備65℃水??；無(wú)水乙醇；制冰機；1.5ml離心管；2ml離心管

2. 按照標簽所示在緩沖液IB中加入異丙醇，在DNA Wash Buffer和緩沖液WB中加入無(wú)水乙醇，混勻后蓋緊瓶蓋后常溫貯存備用。

3. 每次使用前請檢查緩沖液IL，緩沖液IB是否有沉淀生成，如果出現沉淀，37℃溫浴至沉淀溶解后再使用。

● 標準操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在常溫下離心。

1. 液氮充分研磨樣品。

2. 收集研磨成粉末的50 mg樣品，置于1.5ml離心管中。

3. 加入350 μl65℃預熱的緩沖液 IL，并加入20 μl 蛋白酶K劇烈地漩渦振蕩，確保所有的組織團都分散均勻。

4.65℃水浴20-30min。水浴期間顛倒樣品數次。

5. 加入300 μl緩沖液LF，充分混勻，12,000 rpm (~13,400×g )  離心5分鐘。

6. 小心地把上清液吸至另一新的1.5ml離心管中。注意確保不要打散沉淀團或把組織碎片也一起轉移。 

7. 加入4 μl RNase A，渦旋混勻。常溫放置2min。

8. 加入等體積的緩沖液 IB（請確保已經(jīng)按照標簽加入異丙醇），充分混勻。如：向300μl上清中加入300 μl 緩沖液 IB。  

9. 把上述混勻的液體轉移到吸附柱CG上。10,000×g離心1 min以結合DNA，棄去濾出液體。純化柱最大容量為750 μl,如果混合液大于750 μl,請分兩次過(guò)柱。 

10. 將吸附柱重新套回收集管中，加入500μl 緩沖液WB（請確保已經(jīng)按照標簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；

11. 將吸附柱重新套回收集管中，加入600μl DNA Wash Buffer（請確保已經(jīng)按照標簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，10,000×g離心1min,倒棄流出液；

注意：DNA Wash Buffer使用前須按要求用無(wú)水乙醇稀釋。如果放入冰箱中，使用前須恢復到室溫。 

12.再加入600 μl DNA Wash Buffer（請確保已經(jīng)按照標簽加入無(wú)水乙醇）至柱子中，8,000×g離心1min,棄去流出液；

13. 將吸附柱重新套回2ml收集管中，最大轉速（>13000×g）離心空結合柱1min以干燥柱子的基質(zhì)；這一步對下面的洗脫步驟至關(guān)重要。 

14. 將柱子置于1.5 ml滅菌離心管，加入50-150 μl  65℃預熱的洗脫緩沖液EB至柱子的膜中央。常溫靜置5 min； 

15. 常溫下，離心(>13000g)1min，以洗脫DNA。保留含DNA的流出液。將DNA儲于-20℃。

● DNA濃度及純度檢測：

基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度?？膳渲?.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應在23 kb以上。使用分光光度計檢測時(shí)， OD₂₆₀/OD₂₈₀比值應為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。