植物原生質(zhì)體制備及轉化試劑盒
貨號
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名稱(chēng)
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包裝
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RTU4052
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植物原生質(zhì)體制備及轉化試劑盒
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5 ml×40次
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● 產(chǎn)品組成:
組分貨號
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名稱(chēng)
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規格
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貯存
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運輸
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RTU4052-01
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溶液I-酶溶解溶液(2×)
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100 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-02
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溶液II-漂洗溶液
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200 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-03
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溶液III-重懸溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-04
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組份IV-轉化試劑
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5 ml
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-20℃
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RT
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RTU4052-05
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溶液V-培養溶液
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25 ml
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-20℃
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RT
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BME
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還原劑
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1 ml
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RT
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RT
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BSA-02
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50mg/ml BSA溶液
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5 ml
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-20℃
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RT
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說(shuō)明書(shū)
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一份
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:
植物原生質(zhì)體是指脫去全部細胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型,是細胞無(wú)性系變異和突變體篩選的重要來(lái)源,同時(shí)也是植物遺傳工程的理想受體和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù),其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成,因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分,去除細胞壁,即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導原生質(zhì)體融合,現在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。聚乙二醇(PEG)作為一種高分子化合物,合適的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應,原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連,隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗,使原生質(zhì)體融合得以完成。
按照每次使用5
ml酶消化體系計算,本試劑盒可用于40次酶消化反應。本試劑盒每個(gè)5 ml反應體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片),操作較好的情況下每5 ml體系可獲得約50-70萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體(不同植物不同操作會(huì )有一定的差異),可滿(mǎn)足約25-70個(gè)樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉染操作(按照每樣1-2萬(wàn)個(gè)細胞計算)。
原生質(zhì)體轉化時(shí),本試劑盒可以用于相當于6孔板40個(gè)孔的樣品,12孔板80個(gè)孔的樣品,或24孔板160個(gè)孔的樣品的轉化。
● 貯存和效期:
-20oC保存,至少一年有效。
組分I,II,III,V 4℃存放3-5天不會(huì )影響使用效果,長(cháng)期不用,按照標簽℃貯存。
試劑盒常溫運輸。
● 使用說(shuō)明:
需要準備的材料(試劑盒不提供):
剪尖吸頭(剪尖后可以用酒精燈過(guò)火將吸頭處理平滑);纖維素酶R-10;離析酶R-10;平頭鑷子;70μm細胞過(guò)濾篩;一次性刀片;50ml離心管;1.5ml離心管;水浴鍋。
一、原生質(zhì)體分離:
即用型酶溶液配制
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5 ml配制量
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10 ml 配制量
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溶液I(2×)
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2.5
ml
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5
ml
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纖維素酶R-10
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0.075克
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0.15 克
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離析酶R-10
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0.02 克
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0.04 克
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混勻后 55℃水浴 10 min,期間顛倒混勻 2-3次,冷卻至常溫后加入以下成分。
注:55oC孵育可以有效滅活DNase和Protease,并促進(jìn)酶溶解
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還原劑
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2.5
μl
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5
μl
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50mg/ml
BSA
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0.1
ml
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0.2
ml
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滅菌水
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定容至5 ml
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定容至10 ml
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注:即用型酶溶液現用現配,不建議配制后凍存后再使用;
溶解好的正常酶溶液應為澄清棕黃色溶液,如使用純度不好的酶,溶液為不溶解的乳白色懸濁液,不能使用。
1. 酶解:
取生長(cháng)狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm的小條,按照0.1
克葉片(擬南芥約15-20個(gè)葉片)加5
ml即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中,避光,無(wú)需震蕩,常溫(20-25℃)酶解3小時(shí),間歇混勻。
注:酶解時(shí)間與葉片種類(lèi),葉片生長(cháng)狀態(tài)有關(guān),請根據實(shí)驗需要適當調整酶解時(shí)間。3小時(shí)為擬南芥葉片推薦的酶解時(shí)間。如條件允許,可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min,以使酶溶液更好地進(jìn)入細胞間隙。酶溶液變?yōu)榫G色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)有分離,溶液為濃綠色表明原生質(zhì)體已經(jīng)大量分離。擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50 μm,顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質(zhì)體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀,葉綠體分散在整個(gè)細胞內,說(shuō)明狀態(tài)較好;如呈現不規則形狀,說(shuō)明原生質(zhì)體破碎或即將破碎。
2. 漂洗:
酶解后加入等體積的溶液II,如使用5 ml酶解體系,加入5 ml溶液II,輕柔混勻。
3. 過(guò)濾:
用孔徑70 μm篩網(wǎng)過(guò)濾步驟2中的溶液,去除未消化的葉片,收集濾出液于50 ml離心管中。
4. 第一次收集:
濾出液100g常溫離心 2分鐘,盡量去除上清。
注:為了避免原生質(zhì)體離心時(shí)貼在管壁,建議整個(gè)實(shí)驗過(guò)程使用水平轉頭;離心時(shí),可調低離心機的升速和降速。升速過(guò)快,原生質(zhì)體可能離到管壁上;降速過(guò)快,可能導致管底原生質(zhì)體懸起。
5. 第二次收集:
加入2-5 ml 溶液II,用剪尖的藍吸頭重懸原生質(zhì)體,冰浴30分鐘,原生質(zhì)體在重力作用下可以沉降到離心管底部,盡量吸除上清,收集原生質(zhì)體。(如果發(fā)現原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得率比較低,也可以考慮常溫100 g離心1-2 min收集原生質(zhì)體)。
6. 重懸:
小心去除上清溶液,不要觸動(dòng)原生質(zhì)體沉淀,沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液III中即為原生質(zhì)體溶液。(可以用血球計數板計數,根據原生質(zhì)體數量調整溶液III的加入體積,使得原生質(zhì)體密度為2×105/ml或更高)。
注:制備好的原生質(zhì)體可以在4oC或冰浴保存至少24 h。
二、原生質(zhì)體轉化和培養:
1. 轉化溶液配制:
植物原生質(zhì)體轉化參考下表根據樣品量配制轉化溶液。
轉化溶液現用現配。轉化溶液需要在轉化前至少1小時(shí)配制,以確保轉化試劑溶解充分。轉化溶液配制后盡量當天使用。配制好的轉化溶液4℃保存3-5天之內仍然有較好的轉化效率,但和當天配制的轉化溶液相比,轉化效果可能會(huì )有一定程度的下降。
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120 μl
(1個(gè)樣品)
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1.2 ml
(10個(gè)樣品)
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5 ml
(約40個(gè)樣品)
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轉化試劑粉末
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48
mg
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480
mg
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2
g
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轉化試劑溶解液(2×)
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60
μl
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0.6
ml
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2.5
ml
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滅菌水
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定容至120 μl
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定容至1.2 ml
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定容至5 ml
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2. 準備質(zhì)粒:
取10 μl質(zhì)粒DNA(10-20
μg,濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注:質(zhì)粒大小建議為5-10
kb,質(zhì)粒濃度為1-2 μg/μl左右;
原生質(zhì)體轉化對于質(zhì)粒的純度要求較高,盡量使用高純度的質(zhì)粒。
3. 質(zhì)粒轉化:
3.1 質(zhì)粒管中加入100 μl原生質(zhì)體溶液(原生質(zhì)體密度為2×105/ml,約2萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體),輕柔混勻。
3.2 加入等體積即110 μl 步驟1事先準備好的轉化溶液,輕彈管底,輕柔混勻,常溫25℃放置5-15分鐘。
注:最長(cháng)可以孵育15 min,但通常孵育5min時(shí)間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時(shí)間對于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需要通過(guò)實(shí)驗摸索。
4. 終止轉化:
加入2倍體積即440 μl 溶液II,輕柔徹底混勻,終止轉化過(guò)程。
5. 收集原生質(zhì)體:
常溫100g離心1-2分鐘,盡量去除上清。
注:由于轉化后的溶液會(huì )非常粘稠,加入溶液II后離心1
min通??梢允乖|(zhì)體聚集在管底,但使用某些突變體時(shí)為減少原生質(zhì)體損失,可將離心時(shí)間延長(cháng)到2 min。
6. 原生質(zhì)體漂洗:
加入500 μl溶液II輕輕重懸原生質(zhì)體,常溫100g離心1 min,盡量去除殘留的上清。注:本步驟可以充分去除殘留的轉染試劑溶液中的組分,避免轉染試劑溶液中的組分對于后續的不良影響。
7. 原生質(zhì)體重懸:
沉淀中加入1
ml溶液V,輕柔重懸。
8. 原生質(zhì)體培養:
將離心管水平放置,23-25oC弱光培養。
注:根據實(shí)驗需求確定孵育時(shí)間。RNA分析孵育2-6小時(shí);酶活性分析和蛋白標記實(shí)驗孵育2-16小時(shí);基因編輯的效果在轉染24小時(shí)后可能被檢測到。
三、實(shí)驗示例:
使用原生質(zhì)體植物原生質(zhì)體制備及轉化試劑盒轉染擬南芥原生質(zhì)體的效果圖。
實(shí)驗步驟:稱(chēng)取0.48
g轉化試劑于2 ml 離心管中,加入轉化試劑溶解液后,顛倒混勻,蒸餾水定容至2 ml,使轉化試劑充分溶解后備用。在2 ml的圓底離心管中加入10 μl(20 μg)EGFP質(zhì)粒
(植物用綠色熒光蛋白),加入100 μl制備好的原生質(zhì)體,輕柔混勻后加入110 μl當日配制好的轉化試劑溶液,輕柔混勻,常溫靜置5
min后加入440 μl溶液II終止轉化,輕輕顛倒混勻,常溫100 g離心1 min,去除上清,再加入0.5 ml溶液II,輕柔重懸原生質(zhì)體,常溫100 g離心1 min后,盡量去除上清,收集原生質(zhì)體。加入1 ml溶液V,小心重懸原生質(zhì)體后水平放置25℃培養過(guò)夜(約16h),次日于熒光顯微鏡下檢測EGFP熒光信號。
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實(shí)驗植物:水稻
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實(shí)驗植物:擬南芥
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